Cryopréservation

 

Matériel :

Cellules/tissus biologiques (ex : lignées cellulaires, spermatozoïdes, ovocytes, embryons)

Milieu de culture spécifique (DMEM, RPMI, FBS, etc.)

Cryoprotecteurs (DMSO, glycérol, éthylène glycol)

Cryotubes stériles

Boîte de congélation à refroidissement contrôlé (-1°C/min)

Azote liquide (-196°C)

Bain-marie à 37°C pour décongélation

Hotte à flux laminaire

 

Méthode :

Préparation des échantillons

Cultiver les cellules dans des conditions optimales (37°C, 5% CO₂) et récolter lorsqu’elles atteignent 70-80% de confluence.

Centrifuger à 300g pendant 5 minutes et éliminer le surnageant.

Resuspendre dans un milieu cryoprotecteur (ex : 90% FBS + 10% DMSO).

Congélation progressive

Aliquoter la suspension cellulaire dans des cryotubes stériles.

Placer les cryotubes dans une boîte de congélation contrôlée (-1°C/min) pendant 24h à -80°C.

 

Stockage en azote liquide :

Après 24h, transférer les cryotubes dans un réservoir d’azote liquide (-196°C) pour stockage à long terme.

 

Décongélation :

Plonger rapidement le cryotube dans un bain-marie à 37°C jusqu’à dissolution complète de l’échantillon congelé.

Centrifuger, laver avec un milieu de culture sans cryoprotecteur et re-semer les cellules.

 

Références :

"Cryoconservation de cellules spermatiques et de cellules souches pluripotentes de mammifères dans un milieu synthétique et chimiquement défini", Lucie Gavin-Plagne (2018)

"Cryoconservation d’embryons bovins produits in vitro et biopsiés", Sarah Janati Idrissi (2022)

Note : en français, chercher avec le mot "Cryoconservation"

Cryobiose

 

Matériel :

Organismes capables de cryobiose (ex : nématodes antarctiques, insectes résistants au gel)

Chambre climatique programmable (de +20°C à -80°C)

Cryomicroscope pour observation in situ

Thermomètre infrarouge

Bain-marie pour réactivation

 

Méthode :

Pré-conditionnement des organismes

Maintenir les spécimens à 4°C pendant plusieurs jours pour acclimatation.

Réduire progressivement la température jusqu’à atteindre des valeurs subzéro (-20°C à -80°C).

Observation de la cryobiose

Vérifier la capacité des organismes à résister au gel sans cristallisation intracellulaire (observation sous cryomicroscope).

 

Réactivation :

Réchauffer lentement jusqu’à température ambiante.

Ajouter progressivement de l’eau ou un milieu de culture pour restaurer l’activité cellulaire.

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